Synthèse d'oligonucléotide

La synthèse d'oligonucléotide est la synthèse chimique de fragments assez courts d'acide nucléique avec une structure définie.


Catégories :

Synthèse chimique - Réaction chimique - Chimie générale

Recherche sur Google Images :


Source image : fr.wikipedia.org
Cette image est un résultat de recherche de Google Image. Elle est peut-être réduite par rapport à l'originale et/ou protégée par des droits d'auteur.

Page(s) en rapport avec ce sujet :

  • Le nombre d'oligonucléotides ayant une séquence correcte peut être drastiquement diminué en cas d'une synthèse supérieure à 25 nucléotides.... (source : books.google)

La synthèse d'oligonucléotide est la synthèse chimique de fragments assez courts d'acide nucléique avec une structure définie.

Principe

La technique est beaucoup utilisée dans les laboratoires. Elle permet d'obtenir un accès inédit ou peu couteux a des oligonucléotides avec la séquence de nucléotides désirée. Le procédé utilise comme building block des nucléosides de type désoxyadénosine (dA), la désoxythymidine (dT), la désoxycytidine (dC) et la désoxyguanosine (G) pour l'ADN et de type adénosine (A), la thymidine (T), la cytidine (C) et la guanosine (G) pour l'ARN sous forme de phosphoramidite. La technique de départ a pour point de départ un support solide sur lequel est greffé le premier nucléotide. Une fois la synthèse terminée, l'oligonucléotide va être scindé du support solide par un clivage chimique.

Pour obtenir l'oligonucléotide désiré, la synthèse s'effectue selon plusieurs cycles de synthèse. A chaque cycle, un nucléotide est incorporé sur la chaine oligonucléotidique en croissance. Tandis que les enzymes effectue la synthèse de l'ADN ou de l'ARN dans le sens 5'vers 3', la synthèse chimique des oligonucléotide s'effectue dans le sens 3'vers 5'. Le processus s'effectue de manière automatisée par un synthétiseur depuis la fin des années 1970. Les produits sont fréquemment purifiés par HPLC pour obtenir l'oligonucléotide en plus grande pureté. Le plus souvent, les oligonucléotides synthétisés ont longueur d'environ 15-25 nucléotides et sont utilisés comme oligonucléotide antisens, small interfering ARN, sondes pour détecter les mutations de l'ADN ou l'ARN par hybridation, ou comme primers dans le séquencage et l'augmentcation de l'ADN.

Histoire

Synthèse avec phosphodiester

La première synthèse d'ADN a été mise au point par H Gobind Khorana dans les années 1960. Les réactions s'effectuent en solution et chaque produit doit être isolé avant de passer à l'étape suivante. Khorana a utilisé cette méthode en combinaison avec des méthodes enzymatiques et a réussi à synthétiser un ARN de 126 nucléotides.

Synthèse avec phosphotriester

Synthèse avec phosphite triester

Cycle de synthèse

Cycle de synthèse par la méthode des phosphoramidites

Dans un premier temps le groupement protecteur de l'hydroxyle en 5'est clivé clivé avec une solution d'acide trichloroacétique. Ce groupement le diméthoxytrityl a une coleur orange une fois libéré; L'efficacité de chaque cycle de couplage peut être evalué en effectuant un dosage UV des solutions trityle. Pour cette raison, la solution de diméthxytril est collectée.

Le phosphoramidite protégé par un groupement cyanoéthyle est introduit et réagit avec l'hydroxyl 5'qui vient d'être déprotégé. Le couplage s'effectue en présence de tétrazole, un acide faible servant d'activateur pour permettre le couplage et la formation d'un phosphite triester.

Le couplage à chaque étape de synthèse n'est jamais totale et certains hydroxyle en 5'vont rester libres. Pour eviter la formation d'oligonucléotide tronqués, de l'acide acétique est utilisé afin d'acétyler les hydroxyle libre et de les empêcher de réagir lors des cycles suivant de synthèses. EN effet, les ligonucléotides acétylés seront plus faciles a séparer ques des oligonucléotides tronqués.

La liaison phosphite synthétisé à l'étape de couplage est instable. Une étape doxydation permet d'obtenir une liaison phosphate diester;Une solution de diiode dans du tetrahydrofurane sert à donneur un atome d'oxygène. La réaction d'oxyddation est rapide et termine le cycle de synthèse.

Traitement après synthèse

Le rendement de couplage moyen à chaque cycle est de l'ordre de 98-99%. Le dosage des solution des diméthoxytriltyle permet d'obtenir le rendement exacte de chaque étape et est effectué de façon automatique par le synthétiseur. Une étape de purification doit avoir lieu après la synthèse. Le premier but de la purification est d'éliminer les groupements de protections et l'ammoniaque utilisé au cours de la déprotection et le clivage de l'oligonucléotide. D'autre part, une quantité d'oligonucléotides tronqués non négligeable a été constituée lors de la synthèse et doit être éliminée


Synthèse d'oligonucléotides modifiés

Plusieurs procédes permettent d'introduire des nucléotides modifiés dans un oligonucléotide


Recherche sur Amazone (livres) :



Principaux mots-clés de cette page : synthèse - oligonucléotide - nucléotides - cycles - couplage - solution - étape - obtenir - adn - arn - effectue - acide - groupement - modifiés - chimique - phosphoramidite - support - solide - premier - méthode -

Ce texte est issu de l'encyclopédie Wikipedia. Vous pouvez consulter sa version originale dans cette encyclopédie à l'adresse http://fr.wikipedia.org/wiki/Synth%C3%A8se_d%27oligonucl%C3%A9otide.
Voir la liste des contributeurs.
La version présentée ici à été extraite depuis cette source le 30/11/2010.
Ce texte est disponible sous les termes de la licence de documentation libre GNU (GFDL).
La liste des définitions proposées en tête de page est une sélection parmi les résultats obtenus à l'aide de la commande "define:" de Google.
Cette page fait partie du projet Wikibis.
Accueil Recherche Aller au contenuDébut page
ContactContact ImprimerImprimer liens d'évitement et raccourcis clavierAccessibilité
Aller au menu